La Universidad de El Salvador fue fundada el 16 de febrero de 1841, por Decreto Legislativo de la Asamblea Constituyente,38​39​ emitido durante el mandato del Presidente de la República, Juan Lindo,29​40​ ante la decidida intervención del general Francisco MalespÃn.41​42​ La comunidad universitaria, frente a este hecho histórico, considera a Juan Lindo como el fundador del primer centro de educación superior del paÃs;43​44​45​46​ pero algunos historiadores rechazan esta idea, alegando que el decreto legislativo de erección de la alma máter nunca fue aprobado por iniciativa presidencial;47​ o argumentando que el nacimiento de la UES se debe exclusivamente al trabajo de la Asamblea Constituyente que la estableció legalmente;48​ o bien por afirmar que Juan Lindo en realidad se opuso a la creación de esta universidad pública.49​ La UES fue erigida con el objetivo de proporcionar un centro de educación superior para la juventud nacional, y asà evitar que los salvadoreños que tenÃan la posibilidad y el deseo de cursar estudios superiores, decidieran emigrar a Guatemala o a Nicaragua para completar su formación académica, respectivamente, en la Universidad de San Carlos o en la Universidad de León, tal como lo hacÃan desde la época colonial.50​51​
El Decreto Legislativo de Fundación de la Universidad de El Salvador fue expedido por iniciativa de los diputados de la Asamblea Constituyente, Narciso Monterrey y Antonio José Cañas,52​53​ y firmado el mismo dÃa de su aprobación por el presidente Juan Lindo.54​ En sus primeros años, la UES tuvo una existencia precaria por el exiguo apoyo económico que recibÃa por parte del Estado.
Anteriormente, el 2 de febrero de 1841, El Salvador habÃa sido declarado formalmente como Estado independiente de la extinta República Federal de Centroamérica por la misma Asamblea Constituyente que aprobarÃa el decreto legislativo de creación de la UES,55​ y que posteriormente emitirÃa también la Constitución del 18 de febrero de 1841,56​ con la cual quedaba derogada la que habÃa sido expedida el 12 de junio de 1824.57​58​ Las bases de esta nueva Constitución ya habÃan sido fijadas por este mismo organismo colegiado mediante decreto legislativo del 24 de julio de 1840.59​ Esta Asamblea Constituyente iniciarÃa sus sesiones el 23 de junio de 1840 y las clausurarÃa el 19 de febrero de 1841.60​
La UES nació al mismo tiempo que El Salvador comenzaba a organizarse como Estado independiente de la desaparecida Federación Centroamericana y bajo una fuerte influencia de la Iglesia católica.61​ Sin embargo, la identidad de la Universidad de El Salvador se formó mientras tomó protagonismo en el desarrollo de los acontecimientos históricos, como es el caso de la Reforma Agraria Liberal ejecutada por el gobierno del presidente Rafael ZaldÃvar, con las leyes de extinción de las tierras comunales y ejidales de 1881 y 1882, respectivamente, en la que los académicos universitarios realizaron un fuerte cuestionamiento sobre esta reforma agraria inversa, y fue asà como con hechos como este se reconoció el inicio de una universidad crÃtica.62​
Por el mismo Decreto Legislativo del 16 de febrero de 1841 fue fundado conjuntamente con la Universidad de El Salvador un centro de educación media, conocido como el «Colegio de la Asunción»,63​ con el propósito de preparar a los bachilleres que posteriormente ingresarÃan a estudiar en la alma máter.64​
El Colegio de la Asunción se instaló el 16 de octubre de 1841 en el edificio que habÃa pertenecido al convento católico de San Francisco. La primera matrÃcula fue de ocho estudiantes, de los cuales solo uno concluyó su carrera. Su primer rector fue el presbÃtero católico Crisanto Salazar,65​ quien duró en sus funciones hasta febrero de 1842.66​67​ La UES, entre tanto, tenÃa reservado su espacio en este mismo local, en cuya fachada principal se leÃa la inscripción «El General de la Universidad».68​69​70​ El 15 de mayo de 1843, por orden del presidente Juan José Guzmán, el doctor Eugenio Aguilar fue nombrado rector de la Universidad de El Salvador y catedrático de filosofÃa, quien desempeñarÃa sus labores dentro de la UES hasta finales de 1845; y aunque se habÃa anunciado la apertura de sus clases para el 1 de julio de 1843, éstas solo comenzaron a ser impartidas por él a partir del 11 de agosto de 1843, contando con la asistencia de 23 estudiantes diarios.71​72​73​
Posteriormente Eugenio Aguilar llegarÃa a ocupar la silla presidencial entre 1846 y 1848.74​ Pero la alma máter tendrÃa que esperar hasta 1847 para iniciar la vida universitaria propiamente dicha cuando recibió a los primeros 23 bachilleres graduados en 1846 en el Colegio de la Asunción.75​76​ El 4 de junio de 1846, durante el gobierno del presidente Eugenio Aguilar, se ordenó la construcción de un edificio propio para la UES.77​ Los primeros estatutos de la alma máter, entre tanto, fueron emitidos por el Órgano Ejecutivo el 20 de diciembre de 1847;78​79​ aunque serÃan sometidos posteriormente a la aprobación del parlamento salvadoreño bicameral, el cual, finalmente, decidió emitir unos nuevos estatutos para la UES el 27 de febrero de 1849.80​
El primer egresado de la promoción de 1846 del Colegio de la Asunción fue el joven Ireneo Chacón81​ al obtener su Diploma de Bachiller en Derecho Civil. Ireneo Chacón se convertirÃa también en el primer graduado de la UES al recibir su tÃtulo de licenciado, y algunos años después llegarÃa a ser el primer rector de la alma máter formado en su seno.82​ Su tÃtulo de licenciado lo obtuvo en 1851 por parte de la Facultad de Jurisprudencia.83​
Por medio del decreto ejecutivo del 21 de marzo de 1841 fue creada la TesorerÃa EspecÃfica de Instrucción Pública, cuyo objeto de recaudación serÃan los productos de la ReceptorÃa de Zacatecoluca. Con estos fondos se buscaba reanimar el trabajo de la UES.72​
El aumento del número de estudiantes hizo que el primer local del Colegio de la Asunción fuera insuficiente para atender la demanda de ingreso a sus aulas. Por esta razón, el 3 de diciembre de 1844 fue trasladado al local que habÃa albergado al antiguo convento católico de Santo Domingo.84​85​ Sin embargo, el Colegio de la Asunción estuvo a punto de cerrarse en 1844 ante la escasez de recursos económicos necesarios para su sostenimiento, por lo que su rector le pidió ayuda al presidente Francisco MalespÃn, quien le entrega sus charreteras de oro puro y espada con empuñadura del mismo precioso metal, además de un casco de plata, para que el rector empeñara esos objetos y asà pagara las deudas contraÃdas con el fin de que el Colegio de la Asunción siguiera funcionando. Pero el rector le devolvió esas prendas porque consiguió por otros medios el dinero necesario para cubrir la cantidad adeudada.86​87​
En la UES, desde el mismo momento en que comenzó su vida real, se fundaron y organizaron las primeras cátedras y se rindieron los primeros exámenes tanto escritos como orales.79​88​ Y hacia 1850 comienzan a delinearse las diferentes facultades de la UES.89​
La influencia del clero católico en las actividades educativas del Colegio de la Asunción era muy grande. Los estudiantes eran sometidos a un severo régimen disciplinario y tenÃan prohibida toda lectura que no estuviera preparada de antemano. Las actividades académicas se fundamentaban en un concepto exclusivamente religioso de la vida. En 1845, ante la actitud de rebeldÃa demostrada por la juventud salvadoreña contra este sistema educativo represor y enemigo del librepensamiento, el primer obispo católico de San Salvador, Jorge de Viteri y Ungo, conocido por su actuación intolerante y autoritaria, intervino en este conflicto estudiantil ordenando la expulsión de siete jóvenes del Colegio de la Asunción, al cual ya no regresaron más.90​91​
El gobierno de la UES, de acuerdo con los estatutos del 20 de diciembre de 1847, estaba dividido entre el Claustro Pleno, formado por todos los académicos a nivel nacional; el Claustro de Consiliarios, integrado por los catedráticos universitarios de las distintas secciones y dos representantes de cada una de las clases, quienes eran elegidos por el Claustro Pleno; y el Claustro de Hacienda, compuesto por cinco miembros encargados de los fondos de la UES, los cuales también fueron elegidos por el Claustro Pleno. Por mayorÃa de votos, el Claustro Pleno nombró al rector, vicerrector, secretario, tesorero y bibliotecario de la alma máter.79​78​
El presidente Eugenio Aguilar es considerado por diversas fuentes como el verdadero primer rector de la UES;77​72​ no obstante que las mismas listas de rectores aparecidas en las publicaciones oficiales de la alma máter le otorgan tal distinción al doctor Crisanto Salazar,92​93​ quien realmente fue el primer rector del Colegio de la Asunción.94​ Esto se debe a que al haber sido fundados al mismo tiempo estos dos establecimientos educativos, se han producido errores en cuanto a quien fue el primer rector de cada uno de ellos, ya que el Colegio de la Asunción comenzó sus actividades antes de que las iniciara la UES.95​
Por Decreto Ejecutivo del 15 de noviembre de 1847, publicado en la Gaceta de El Salvador N.º 36, Tomo N.º 1, del 26 de noviembre de 1847,96​ el presidente Eugenio Aguilar establece en el Colegio de la Asunción una cátedra de medicina.97​ Esta fecha es considerada por la comunidad universitaria como la de la fundación de la Facultad de Medicina;98​79​ si bien la misma y el Protomedicato fueron organizados hasta el 28 de febrero de 1849, según una noticia publicada en la Gaceta de El Salvador N.º 1, Tomo N.º 2, del 2 de marzo de 1849.99​